Suitability of Selected Markers for Identification of Elements of the Intestinal Nervous System (INS)

 

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Abstract

The possibility of identifying and characterising elements of the enteric nervous system based on their contents of cathepsin D, chromogranin A, neuronal specific enolase and S-100 protein was studied in colorectal specimens (operative full-thickness, seromuscular and mucosomuscular biopsies) obtained from 15 children, aged 2 days to 10 years. Nine patients suffered from Hirschsprung's disease, and two from chronic constipation. Four neonates with imperforate anus or meconium ileus composed the control group. All markers were identified immunohistochemically by antibodies against human antigens with appropriate detection methods.

Chromogranin A staining was not always adequate to identify all neuronal cell bodies and other nervous elements. However, it proved superior to the other methods in the depiction of neuroendocrine cells in the intestinal mucosa. Cathepsin D antibodies stained normal and abnormal neural cells with different intensity; nerve fibres were not stained. This marker did not allow an unequivocal differentiation of ganglion cells from macrophages within the submucosa; the latter exhibited exceptionally strong marking and in some cases represented the predominant elements in this area. Neuronal specific enolase was distinctly expressed in nerve cells and fibres of the intestinal wall. Atrophic and hypoplastic features could be identified, suggesting that this method may give some insight into functional aspects. Continuous connections between ganglions were also observed. S-100 protein antibodies resulted in a negative image of unstained ganglion cells surrounded by extensively marked Schwann cells and neural fibres.

With respect to clinical application, all these markers may provide supplementary information for the differential diagnosis of intestinal motility disorders.

Résumé

La possibilité d'identifier et de caractériser les éléments du système nerveux entérique basée sur la présence de Cathépsine D, de Chromogranine A, d'Enolase neuronale spécifique et de Protéine S-100 a été étudiée sur des biopsies colo-rectales (biopsie pariétale totale, séromusculaire et mucomusculaire). Ces biopsies ont été obtenues chez 15 enfants âgés de 2 jours à 10 ans. Neuf patients souffraient de maladie de Hirschsprung et 2 de constipation chronique. Quatre nouveau-nés avec une imperforation anale ou un iléus méconial composent le groupe contrôle. Tous les marqueurs étaient identifiés par imunohistochimie en utilisant des anticorps dirigés contre les antigènes humains.

La coloration par la Chromogranine A n'est pas toujours satisfaisante pour identifier tous les corps cellulaires neuronaux et les autres éléments nerveux, mais cette technique a été démontrée comme supérieure aux autres méthodes pour la recherche des cellules neuro-endocrines dans la muqueuse intestinale. L'anticorps Cathépsine D colore les cellules neurales normales et anormales avec une intensité différente. Les fibres nerveuses ne sont pas mises en évidence. Le marqueur ne permet pas une différenciation des cellules ganglionnaires des macrophages à l'intérieur de la muqueuse. Ce dernier, exceptionnellement, entraîne un marquage important dans quelques cas et est représenté comme l'élément prédominant. Les enolases spécifiques neuronales sont exprimées dans les cellules nerveuses et les fibres de la paroi intestinale. Les atrophies et hypoplasies peuvent être identifiées suggérant que cette méthode peut donner quelques informations sur l'aspect fonctionnel. Les connections entre les ganglions sont aussi observées. Les anticorps Protéine S-100 entraînent une image négative des cellules ganglionnaires non marquées entourées par des cellules de Schwann et des fibres nerveuses marquées de manière intensive. En ce qui concerne les applications cliniques, ces marqueurs peuvent donner des informations supplémentaires sur le diagnostic différentiel des désordres de la motilité intestinale.

Resumen

Hemos investigado la posibilidad de identificar y caracterizar los elementos del sistema nervioso entérico, basados en su contenido en catepsina D, cromogranina A, enolasa neuronal específica y proteína S-100 en muestras colo-rectales (pared completa obtenida operatoriamente y biopsias seromusculares y mucomusculares) obtenidas de 15 niños de edades entre 2 días y 10 años. Nueve tenían enfermedad de Hirschsprung y 2 estreñimiento crónico. Cuatro recién nacidos con ano imperforado o ileon meconial compusieron el grupo control. Todos los marcadores se identificaron inmuno-histoquímicamente con anticuerpos contra los antígenos humanos con métodos apropiados de detección. La tinción con cromogranina A no siempre fue adecuada para identificar los cuerpos neuronales y otros elementos nerviosos. Sin embargo, fue superior a los otros métodos para demostrar las células neuroendocrinas en la mucosa. Los anticuerpos contra catepsina D tiñeron las células normales y anormales con diferente intensidad, y no tiñeron las fibras nerviosas. Este marcador no permitió la diferenciación inequívoca de las células ganglionares de los macrófagos dentro de la submucosa. Estos últimos tenían un marcaje excepcionalmente fuerte y en algunos casos representaban los elementos predominantes en esta área. La enolasa neuroespecífica se expresó claramente en las células nerviosas y en las fibras de la pared intestinal. Se identificaron atrofia e hipoplasia sugiriendo que éste método puede dar alguna utilidad en los aspectos funcionales. Las conexiones continuas entre los ganglios fueron también investigadas. Los anticuerpos antiproteína S-100 resultaron en una imagen negativa de células ganglionares no teñidas, rodeadas por células de Schwann y fibras nerviosas muy marcadamente teñidas. Desde el punto de vista de la aplicación clínica, todos estos marcadores pueden proporcionar información suplementaria para el diagnóstico diferencial de los trastornos de la motilidad.

Zusammenfassung

Die Möglichkeit, Elemente des intestinalen Nervensystems auf der Basis ihres Inhalts an Kathepsin D, Chromogranin A, Neuronenspezifischer Enolase und Protein S-100 zu identifizieren und zu charakterisieren, wurde an Dickdarmschnitten (Resektionspräparate, seromuskuläre und mukosomuskuläre Biopsien) von 15 Kindern im Alter von 2 Tagen bis 15 Jahren geprüft. Neun der Patienten hatten einen M. Hirschsprung, zwei litten an einer chronischen Obstipation unbekannter Ursache. Vier Neugeborene mit Analatresie oder Mekoniumileus wurden als Kontrollgruppe herangezogen. Die genannten Marker wurden immunhistochemisch mit Antikörpern gegen humanes Antigen und durch geeignete Detektionsmethoden dargestellt.

Die Chromogranin A-Färbung führte nicht immer zu adäquater Markierung aller Nervenzellkörper und übrigen neuralen Elemente. Zur Darstellung neuroendokriner Zellen in der intestinalen Mukosa erwies sie sich gegenüber den anderen Methoden jedoch als überlegen. Kathepsin-D-Antikörper färbten normale und abnormale Nervenzellen mit unterschiedlicher Intensität, Nervenfasern jedoch nicht. Dieser Marker ließ eine eindeutige Unterscheidung zwischen Ganglienzellen und Makrophagen in der Submukosa nicht zu; letztere zeigten eine extrem starke Expression von Kathepsin D und waren in einigen Fällen in dieser Region prädominierend. Neuronenspezifische Enolase kennzeichnete Nervenzellen und -fasern deutlich und ließ auch atrophe und hypoplastische Elemente erkennen. Dies kann u. U. dazu beitragen, funktionelle Aspekte zu beleuchten. Darüber hinaus kamen Verbindungen zwischen Ganglien zur Darstellung. Protein S-100-Antikörper erbrachten ein negatives Bild ungefärbter Ganglienzellen, umgeben von ausgeprägt markierten Schwannzellen und Nervenfasern.

In Bezug auf die klinische Relevanz lassen diese Marker einen Informationsgewinn bei der Differenzialdiagnose intestinaler Motilitätsstörungen erwarten.

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Dr. Ewa Dzienis-Koronkiewicz

Department of Paediatric Surgery, Bialystok Medical Academy, Dr. Zamenhof Children's Hospital

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