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Morphologic criteria and detection of apoptosis

Morphologische Kriterien und Nachweis von Apoptose

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Abstract

Apoptosis is an organized, energy dependent process, which leads to cell death. Its definition is based on distinct morphological features [10] and demonstration of internucleosomal DNA degradation [27], executed by selectively activated DNAses [4, 22]. The morphologic hallmarks of apoptosis include chromatic margination, nuclear condensation and fragmentation, and condensation of the cell with preservation of organelles. The process is followed by fragmentation of the cell into membrane-bound apoptotic bodies, which undergo phagocytosis by nearby cells without associated inflammation [10, 11]. Apoptosis characteristically occurs in isolated single cells. The duration of apoptosis is estimated to be from 12 to 24 hours, but in cell culture visible morphologic changes are accomplished in less than two hours [10, 16]. Non-apoptotic cell death, a prototype of which is cell death due to ischemia (oncosis), is characterized by depletion of intracellular ATP stores, swelling of the cell with disruption of organelles and rupture of the plasma membrane [15]. Groups of necrotic cells and inflammation are found in tissues [10, 15].

The significance of apoptosis has mostly been studied using the TUNEL assay that detects DNA strand breaks in tissue sections and allows quantification of apoptotic cells by light microscopy [6]. Common experience seems to be that the TUNEL assay is prone to false positive or negative findings. This has been explained by the dependence of the staining kinetics on the reagent concentration [17], fixation of the tissue [2] and the extent of proteolysis [17].

Active RNA synthesis [12] and DNA damage in necrotic cells [17, 19] may cause non-specific staining. To obtain reliable and reproducible results, TUNEL assay should be carefully standardized by using tissue sections treated with DNAse (positive control of apoptosis). Quantification of apoptosis should include enough microscopic fields and identification of the cell type undergoing apoptosis. The specificity of the results can be substantiated by combining other methods with TUNEL, such as assessment of the pattern of DNA fragmentation or evaluation of the morphological features.

Even though there is high variation in the results obtained in consecutive studies under the same circumstances, increasing evidence shows that TUNEL-positive cardiomyocytes and internucleosomal DNA fragmentation are associated with various cardiac diseases, including acute myocardial infarction and heart failure [reviewed in 5,9]. Some morphological features of apoptosis have been observed in TUNEL-positive cardiomyocytes using light microscopy (Figure 1) or confocal microscopy [20]. Electron microscopic evidence of apoptosis has been found in the degenerating conduction system [7], in experimental heart failure [23], and in human hibernating myocardium [3]. In acutely ischemic myocardium the interpretation of the findings remains controversial, since only non-apoptotic cell morphology has been found in electron microscopy [8, 19]. One explanation might be abortion of the apoptotic program due to the lack of ATP before the morphologic features are fully evident [14]. Another explanation is the possibility that non-apoptotic cell death and apoptosis share common mechanisms in the early phases of the processes [14, 19]. The exact mechanisms of ischemic cell death remain to be clarified and the classification between apoptosis and non-apoptosis cell death to be specified. Recently, caspase activation has emerged as the central molecular event leading to apoptosis, preceding DNA degradation and the development of apoptotic morphology [22, 25]. New methods have been developed to demonstrate caspase activation [1, 13]. Inhibition of caspase may be an efficient way to prevent apoptotic cardiomyocyte death as well as to define and specifically probe the significance of apoptotic cell death in cardiac diseases.

Zusammenfassung

Die Apoptose ist ein strukturierter, energieabhängiger Prozeß, der zum Zelluntergang führt. Histomorphologisch ist er klar definiert und zeigt eine internukleosomale DNA-Degradation, die durch selektiv aktivierte DNAsen vollzogen wird.

Die morphologischen Charakteristika der Apoptose umfassen die Margination von Chromatin, die Kernkondensation und Fragmentation und die Kondensation der Zellen unter Erhalt der Organellen. Diesem Vorgang folgt eine Fragmentation der Zellen in sogenannte apoptopische Körperchen, die später von benachbarten Zellen, meist von Makrophagen phagozytiert werden, ohne daß eine Entzündungsreaktion nachweisbar wäre. Apoptose findet in der Regel an Einzelzellen statt. Die Dauer eines apoptotischen Vorgangs beträgt etwa 12 bis 24 Stunden, wobei in Zellkultur die morphologischen Veränderungen der Apoptose bereits in weniger als zwei Stunden vorliegen können. Der nicht-apoptotische Zelluntergang läßt sich ganz besonders gut als Folge der Ischämie nachweisen und wird Onkose genannt. Bei ihm werden die intrazellulären ATP-Speicher entleert, die Zellen schwellen an, die Organellen rupturieren ebenso wie die Plasmazellmembran. Gruppen nekrotischer Zellen und eine Entzündungsreaktion finden sich hier als morphologisches Charakteristikum. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung von Geweben wird meist der sogenannte TUNEL-Test angewendel, der DNA-Strangbrüche zeigt und eine Quantifizierung apoptotischer Zellen ermöglicht. Nach Erfahrung verschiedener Zentren ist der TUNEL-Test jedoch nicht selten falsch positiv oder falsch negativ. Dies hängt unter anderem mit methodischen Problemen zusammen, die auf der Färbungskinetik, der Konzentration der Reagenzien, der vorbestehenden Fixation der Gewebe und dem Ausmaß der Proteolyse beruhen. Eine aktive Synthese von RNA und DNA-Schäden in nekrotischen Zellen rufen gleichfalls eine unspezifische TUNEL-Reaktion hervor. Um verläßliche und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, sollte der TUNEL-Test laborintern sorgfältig standardisiert werden, wobei als Kontrolle Gewebeschnitte verwendet werden sollten, die mit DNAse vorbehandelt werden und deshalb eine positive Kontrolle der Apoptose darstellen. Die Quantifizierung der Apoptose sollte auf ausreichend vielen Gesichtsfeldern unter gleichzeitiger Benennung der betrofferen Zellen erfolgen. Die Spezifität dieser TUNEL-positiven Ergebnisse sollte mit einer anderen Methode wie zum Beispiel der DNA-Fragmentation (DNA-Leiter) erfolgen.

Obgleich eine große Variation der Ergebnisse zum Apoptosenachweis aus den oben genannten Gründen besteht, ist doch klar geworden, daß TUNEL-positive Kardiomyozyten und eine internukleosomale DNA-Fragmentation gehäuft beim akuten Myokardinfarkt und bei Herzinsuffizienz vorliegen. Die morphologischen Kriterien der Apoptose lassen sich an TUNEL-positiven Kardiomyozyten mittels Lichtmikroskopie (Abbildung 1) oder konfokaler Lasermikroskopie nachweisen. Elektronenmikroskopisch wurde Apoptose auch im Rahmen der Degeneration des Reizleitungssystems, bei experimentellen Untersuchungen zur Herzinsuffizienz und in hibernierendem Myokard des Menschen nachgewiesen. Bei akuter Ischämie ist die Interpretation TUNEL-positiver Zellen noch immer kontrovers, da unter elektromikroskopischen Bedingungen nur nicht-apoptotische Zellen, das heißt nekrotische Zellen, nachgewiesen wurden. Eine Erklärung hierfür könnte der Abbruch des Apoptoseprogramms als Folge eines ATP-Mangels sein, so daß die morphologischen Kriterien der Apoptose sich nicht mehr richtig ausprägen können. Eine andere Erklärung wäre die Möglichkeit, daß der nicht-apoptotische Zelluntergang und die Apoptose einige Mechanismen in der Frühphase des Prozesses gemeinsam haben. Der genaue Mechanismus des ischämischen Zelltods bedarf deshalb weiterer Untersuchungen, damit apoptotische von nicht-apoptotischen Zelluntergangsformen abgegrenzt werden können.

Neue Untersuchungen zeigen auch, daß die Aktivierung von Caspase ein zentraler molekularer Mechanismus ist, der zur Apoptose führt und der einer DNA-Degradation (DNA-Leiterbildung) vorausgeht und damit auch vor der Ausprägung apoptotischer Zellen in der Lichtmikroskopie liegen dürfte. Neue Methoden gestatten es jetzt, die Aktivierung der Caspase nachzuweisen. Die Inhibition der Caspasen könnte im Umkehrschluß eine wirksame Methode zur Vermeidung des apoptotischen Zelluntergangs sein. Therapeutische Ansätze, die bei der Aktivierung der Caspase eingreifen, dürften auch von Bedeutung für die weitere Apoptoseforschung bei kardialen Erkankungen sein.

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References

  1. Black SC, Huang JQ, Rezaiefar P, et al. Co-localization of the cysteine protease caspase-3 with apoptotic myocytes after in vivo myocardial ischemia and reperfusion in the rat. J Mol Cell Cardiol 1998;30:733–42.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  2. Davison FD, Groves M, Scaravilli F. The effects of formalin fixation on the detection of apoptosis in human brain by in situ end labelling of DNA. Histochem J 1995;27:983–8.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  3. Elsässer A, Schlepper M, Klöverkorn W-P, et al. Hibernating myocardium: An incomplete adaptation to ischemia. Circulation 1997;96:2920–31.

    PubMed  Google Scholar 

  4. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNAse that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998;391:43–50.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  5. Freund B, Masters TN, Kostin S, et al. Cardiomyocyte apoptosis in acute and chronic conditions. Bas Res Cardiol 1998;93:85–9.

    Article  Google Scholar 

  6. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992;119:493–501.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  7. James TN, Terasaki F, Pavlovich ER, et al. Apoptosis and pleomorphic michromitochondriosis in the sinus nodes surgically excised from five patients with the long QT syndrome. J Lab Clin Med 1993;122:309–23.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  8. Gottlieb RA, Burleson KA, Kloner RA, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes. J Clin Invest 1994;94:1621–8.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  9. Haunstetter A, Izumo S. Apoptosis: Basic mechanisms and implications for cardiovascular disease. Circ Res 1998;82:1111–29.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  10. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological Phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239–57.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  11. Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 1994;73:2013–26.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  12. Kockx MM, Muhring J, Knaapen MWM, et al. RNA synthesis and splicing interferes with DNA in situ end labeling techniques used to detect apoptosis. Am J Pathol 1998;152:885–8.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  13. Lazebnik YA, Kaufmann SH, Desnoyers S, et al. Cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature 1994;371:346–7.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  14. Leist M, Nicotera P. The shape of cell death. Biochem Biophys Res Commun 1997;236:1–9.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  15. Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 1995;146:3–15.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  16. Messam CA, Pittman RN. Asynchrony and commitment to die during apoptosis. Exp Cell Res 1998;238:389–98.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  17. Migheli A, Cavalla P, Marino S, et al. A study of apoptosis in normal and pathologic nervous tissue after in situ end-labeling of DNA strand breaks. J Neuropath Exp Neurol 1994;1994:606–16.

    Article  Google Scholar 

  18. Negoescu A, Lorimier P, Labat-Moleur F, et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations. J Histochem Cytochem 1996;44:959–68.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  19. Ohno M, Takemura G, Ohno A, et al. „Apoptotic” myocytes in infarct area in rabbit hearts may be oncotic myocytes with DNA fragmentation: Analysis by immunogold electron microscopy combined with in situ nick end-labeling. Circulation 1998;98:1422–30.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  20. Olivetti G, Abbi R, Quaini F, et al. Apoptosis in the failing human heart. N Engl J Med 1997;336:1131–41.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  21. Petito CK, Roberts B. Effect of postmortem interval on in situ end-labeling of DNA oligonucleosomes. J Neuropath Exp Neurol 1995;54:761–5.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

  22. Sanejima K, Toné, S, Kottke TJ, et al. Transition from caspasedependent to caspase-independent mechanisms at the onset of apoptotic execution. J Cell Biol 1998;143:225–39.

    Article  Google Scholar 

  23. Saraste A, Pulkki K, Kallajoki M, et al. Apoptosis in human acute myocardial infarction. Circulation 1997;95:320–3.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  24. Sharov VG, Sabbah HN, Shimoyama H, et al. Evidence of cardiocyte apoptosis in myocardium of dogs with chronic heart failure. Am J Pathol 1996;148:141–9.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  25. Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases: enemies within. Science 1998;28:1312–6.

    Article  Google Scholar 

  26. Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections: in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem 1993;41:7–12.

    PubMed  CAS  Google Scholar 

  27. Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 1980; 284:555–6.

    Article  PubMed  CAS  Google Scholar 

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Saraste, A. Morphologic criteria and detection of apoptosis. Herz 24, 189–195 (1999). https://doi.org/10.1007/BF03044961

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